Metabolismo de Proteínas y de Compuestos Nitrogenados

I. INTRODUCCIÓN.

Las proteínas son sustancias orgánicas que contienen carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. Están compuestas de aminoácidos, sus unidades más simples, algunos de los cuales son esenciales para nuestro organismo. En función de la cantidad de aminoácidos esenciales, se establece la calidad de los distintos tipos de proteínas. Aquellas que contienen cantidades suficientes de cada uno de los aminoácidos esenciales son proteínas de alto valor biológico y, cuando falta un aminoácido esencial, el valor biológico de esa proteína disminuye. El organismo no puede sintetizar proteínas si tan sólo falta un aminoácido esencial¹.

Las proteínas comienzan a digerirse en el estómago, donde son atacadas por la pepsina, liberando algunos aminoácidos. En el duodeno, el jugo pancreático y posteriormente, las enzimas del jugo intestinal completan su digestión. Los aminoácidos se absorben en el intestino delgado, pasan a la sangre y llegan al hígado donde unos se almacenan y otros intervienen en la síntesis o producción de proteínas de diversos tejidos, formación de anticuerpos, etc. Las proteínas de la dieta se usan, principalmente, para la formación de nuevos tejidos o para el reemplazo de las proteínas presentes en el organismo. Sin embargo, la combustión de los aminoácidos tiene un grave inconveniente: la eliminación del amoniaco y las aminas que se liberan en estas reacciones químicas. Estos compuestos son altamente tóxicos para el organismo, por lo que se transforman en urea en el hígado y se eliminan por la orina al filtrarse en los riñones. El hígado degrada los aminoácidos a variados intermediarios metabólicos. Los glucogénicos son transformados a piruvato o intermediarios del ciclo de Krebs, por ejemplo, oxaloacetato (OAA). Por el contrario, los aminoácidos cetogénicos, muchos de los cuales también son glucogénicos, son transformados a cuerpos cetónicos ².

Por otro lado, el catabolismo del grupo hemo (al fin de la vida de los eritrocitos) comienza con la rotura del mismo por la hemo oxidasa para formar biliverdina, y este a su vez convertido en bilirrubina. La formación de biliverdina libera CO, que es unas 100 veces más potente en su unión a la hemoglobina que el O2, y de esta manera, más o menos un 1% de la hemoglobina está bloqueada por CO. La bilirrubina es insoluble y se transporta en la sangre por la albúmina. Aumenta su solubilidad al unirse a dos unidades de ácido glucurónico por la bilirrubina glucuronil transferasa. Las enzimas bacterianas hidrolizan el glucurónico y convierten la bilirrubina en varios productos, uno de ellos el urobilinógeno. Algo de este se absorbe por el intestino y se transporta al riñón, donde se convierte en urobilina y se excreta, dando el color a la orina. Sin embargo, la mayor parte de urobilinógeno es convertido en estercobilina por las bacterias, pigmento mayoritario de las heces. El almacenamiento de energía en el músculo se realiza por la creatina. Esta se sintetiza a partir de arginina, glicina y adición de grupos metilo de la adenosilmetionina. Sobre un 1-2% de la creatina se cicla no enzimáticamente para dar creatinina la cual puede ser detectada en sangre u orina³.

II. COMPETENCIAS.

2.1. Determina cuantitativamente el nivel de proteínas totales, tanto en suero como en orina.

2.2. Determina la concentración de compuestos nitrogenados en suero sanguíneo.

2.3. Analiza la importancia que supone la alteración de valores normales de metabolitos nitrogenados en sangre.

III. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS.

.1. Materiales y equipos

.1.1. Materiales:

A. Biológico:

§ Suero sanguíneo.

§ Orina de diabético (recolectada de 24 horas).

B. De vidrio:

§ 10 tubos de ensayo 13x100.

§ 02 pipetas de 5 ml.

§ 02 beackers 250 ml.

C. Reactivos:

- 02 frascos con 1ml azul de metileno.

- 01 Kit para determinación de Proteínas totales en suero.

- 01 Kit para determinación de Proteínas totales en orina.

- 01 Kit de determinación de urea.

- 01 Kit de determinación de creatinina.

- 01 Kit de determinación de bilirrubinas.

- Alcohol etílico (50 mL).

- Agua destilada (50 mL).

- 50 mL Agua destilada.

- 50 mL Alcohol etílico.

.1.2. Equipos, instrumentos y otros: § 01 espectrofotómetro.

§ 01 Baño maría.

§ 01 Centrífuga.

§ 01 Espectrofotómetro.

§ 06 Micropipetas automáticas de 2-20 μL, 50-100 μL, 100-1000 μL.

§ 01 Cronómetro.

§ 02 Gradillas.

§ 02 pares de guantes descartables.

§ 01 Marcador indeleble.

§ 05 Torundas de algodón.

§ 03 Agujas descartables 20 x 1 ½ “.

§ 20 Tips de micropipetas (2-50 y 100-1000 μL).

§ 10 Cubetas para espectrofotómetro 1 mL.

§ 01 Ligadura.

§ 01 Calculadora.

.2. Procedimientos

.2.1. Determinación de Proteínas Totales en suero.

• Obtener una muestra de sangre de una persona en ayuno.

• Extraer suero de manera usual y realizar la prueba de Determinación de Proteínas Totales en suero de acuerdo al siguiente cuadro:

Blanco Standard Muestra

Tubo

(B) (S) (D)

Agua destilada (µL) 20 --- ---

Suero patrón (µL) --- 20 ---

Muestra (suero) (µL) --- --- 20

Reactivo EDTA/Cu (µL) 1400 1400 1400

Mezclar por agitación suave durante 30 segundos e incubar 15 min a 37°C. Leer a 505 nm, llevando el aparato a cero con el blanco de reactivo. El color es estable 12 horas.

• Cálculos:

Proteínas Totales en suero (g/dL)= D x f

𝑔

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 𝑇 𝑠𝑢𝑒𝑟𝑜( )

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 = ^𝑑𝑙

𝐴𝑏𝑠. 𝑆𝑡

§ Valores de referencia: 6 – 8 g/dL

.2.2. Determinación de Proteínas en Orina.

 Recolectar la orina de una persona diabética durante 24 horas de la siguiente manera:

- Descartar completamente la primera orina de la mañana.

- Recoger luego en un frasco grande (2 Lts. aprox.) o botella limpios y secos el volumen completo de todas las micciones subsiguientes (durante 24 horas), incluyendo la primera orina de la mañana siguiente.

- Durante la recolección conservar la orina en refrigeración hasta su traslado al laboratorio, que deberá realizarse ese mismo día.  Medir el volumen de orina colectada.

• Realizar la prueba de determinación de proteínas en orina de acuerdo al siguiente cuadro:

Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de realizar los ensayos. Después de homogenizar bien el frasco que contiene la orina, tomar la muestra y medir el volumen de la diuresis:

Tubo Blanco Standard Muestra

Standard (µL) --- 20 ---

Muestra (suero) (µL) --- --- 20

Rojo de Pirogalol (µL) 1000 1000 1000

Mezclar por agitación suave e incubar 15 ml a 37°C. Leer a 600 nm, llevando el aparato a cero con el blanco de reactivo. El color es estable 30 min.

• Cálculos:

Proteínas en orina (mg/24 h)= D x f

𝑚𝑔 𝐴𝑏𝑠. 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑜𝑟𝑖𝑛𝑎 ( ) = 𝑥𝑉𝑥1000 24ℎ 𝐴𝑏𝑠. 𝑆𝑡

Siendo:

V= Volumen de la diuresis expresado en litros/24 h 1000=mg/dl del standard.

§ Valores de referencia: 30 – 140 mg/24 h.

§ NOTA: Evitar muestras procedentes de mujeres en periodo de menstruación debido al error en los resultados.

.2.3. Determinación de Bilirrubinas en sangre

• Obtener una muestra de sangre de una persona en ayuno.

• Extraer suero de manera usual, protegiéndolo de la luz directa y realizar la prueba de determinación de bilirrubinas de acuerdo al siguiente cuadro:

Tubo Blanco B. Directa B. Total

Muestra (suero) (µL) 80 80 80

Agua destilada (µL) 1000 1000 ---

Desarrollador (µL) --- --- 1000

Reactivo sulfanílico (µL) 80 --- ---

Diazorreactivo (µL) --- 80 80

Mezclar por inversión cada uno de los tubos. Luego de 5 min leer a 530 nm, llevando el aparato a cero con agua destilada. La lectura de la bilirrubina directa debe ser leída a los5min exactos. Las demás lecturas pueden efectuarse hasta los 15 min.

• Cálculos:

Bilirrubina Total (mg/L)= (T-B)xFactor

Bilirrubina Directa (mg/L)=(D-B)xFactor

Bilirrubina Libre (mg/L)=Bilirrubina Total-Bilirrubina Directa  Valores de Referencia:

Directa: Hasta 2 mg/L

Total: Hasta 10 mg/L

.2.4. Determinación de Urea en sangre

• Obtener una muestra de sangre de una persona en ayuno.

• Obtener suero de manera usual y realizar la prueba de determinación de urea de acuerdo al siguiente cuadro:

En tres tubos 15 x 100 marcados: B, S, M, colocar una gota de agua y agregar:

Tubo Blanco Standard Muestra

Standard (µL) --- 20 ---

Muestra (suero) (µL) --- --- 20

Ureasa (gota) 1 1 1

Mezclar por agitación suave e incubar 5 min a 37°C. Luego agregar:

Reactivo 1 (µL) 1000 1000 1000

Reactivo 2 (µL) 1000 1000 1000

Mezclar por agitación suave e incubar 5 min a 37°C

Agua destilada (mL) 10 10 10

Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 10 min leer en espectrofotómetro a 540 nm, llevando el aparato a cero con el blanco de reactivo.

• Cálculos:

Urea (mg/dL)= D x f

𝑚𝑔

60( )

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 = ^𝑑𝑙

𝐴𝑏𝑠. 𝑆𝑡

BUN (g/L)= D x f

𝑚𝑔

28( )

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 = ^𝑑𝑙

𝐴𝑏𝑠. 𝑆𝑡

§ Valores de referencia: 20 – 45 mg/dL

.2.5. Determinación de Creatinina en sangre

• Obtener una muestra de sangre de una persona en ayuno.

• Obtener suero de manera usual y realizar la prueba de determinación de creatinina de acuerdo al siguiente cuadro:

Preparar el reactivo de trabajo en un frasco de plástico, mezclando en partes iguales ácido pícrico y buffer PLE. Este es estable 15 días a partir de la fecha de preparación.

Seguir el siguiente sistema de tubos:

Tubo Blanco Standard Muestra

Agua (µL) 100 --- ---

Standard (µL) --- 100 ---

Muestra(suero) (µL) --- --- 100

Reactivo de trabajo (µL) 1000 1000 1000

Mezclar e incubar 10 min en baño a 37°C. Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 15 min de retirado del baño, leer el standard (S) y la muestra (D1) a 540 nm, llevando el aparato a cero con el blanco de reactivo. Luego agregar:

Stopper (µL) 50 --- 50

Mezclar. Dejar los tubos 5 min a TA y volver a leer el tubo con la muestra (D2),llevando el equipo a cero con el blanco de reactivo. Luego agregar:

• Cálculos:

Creatinina en suero (mg/L)= (D1-D2) x factor

𝑚𝑔

20( )

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 = ^𝐿

𝐴𝑏𝑠. 𝑆𝑡

§ Valores de referencia:

- Varones: 7-14 mg/L

- Mujeres: 6-12 mg/L

.3. Manejo de Residuos.

• Las torundas de algodón con sangre serán eliminadas en contenedor con bolsa roja y las agujas usadas en recipientes de bioseguridad.

• Posteriormente el material de vidrio deberá ser lavado con detergente y enjuagado con agua destilada. Se envolverá en papel y luego será llevado al horno a una temperatura de 160°C por un lapso de 2 horas para ser esterilizado, quedando de esta manera listo para poder ser utilizado nuevamente en el laboratorio.

IV. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

1. D’ocon Navaza MC, García-Saavedra MJ, Vicente García JC. Fundamentos y Técnicas de Análisis Bioquímicos. Principios de análisis instrumental. 2ª ed.

España: Thompson- Paraninfo; 2005.

2. Govantes J, Lorenzo P, Govantes C. Manual Normon. 8ª ed. Madrid España: Laboratorios Normon S.A.; 2006.

3. Wiener lab. Group. Vademecum de Reactivos [en línea] 2010 [acceso: 2010 agosto 29] Disponible en:

http://www.wiener-lab.com.ar/wienerw/corp/vademecum.vsp

V. FUNDAMENTACIÓN METODOLÓGICA Y CLÍNICA.

5.1. PROTEÍNAS TOTALES EN SUERO/PROTEINEMIA.

Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.

Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el organismo, esenciales para la vida. Actúan como elementos estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulación, etc. En el plasma, las proteínas contribuyen a mantener el volumen del fluido circulante, transportan sustancias relativamente insolubles y actúan en la inactivación de compuestos tóxicos y en la defensa contra agentes invasores.

La determinación de proteínas totales es útil para el monitoreo de cambios ocasionados por diversos estados de enfermedad. En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones prolongadas, etc., suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que, en otras como mieloma múltiple, endocarditis bacteriana y hemoconcentraciones de diversos orígenes, (ej.: deshidratación) se observan hiperproteinemias.

5.2. PROTEÍNAS EN ORINA/PROTEINURIA.

Las proteínas presentes en la muestra reaccionan en medio ácido con el complejo Rojo de

Pirogalol-Molibdato originando un nuevo complejo coloreado que se cuantifica espectrofotométricamente a 600 nm.

Una cantidad de proteínas plasmáticas de pequeño peso molecular son filtradas normalmente en forma libre a través del glomérulo renal y luego son, en parte, reabsorbidas por los túbulos renales. Hay condiciones fisiológicas o benignas donde se puede observar un aumento en la excreción urinaria de proteínas como en el ejercicio violento, fiebre, hipotermia, embarazo.

La medición de las proteínas urinarias es importante en la detección de patología renal. La proteinuria en la enfermedad renal puede resultar de una disfunción glomerular o tubular. En el primer caso se da por un aumento en el pasaje a través de los capilares del glomérulo y caracterizada por la pérdida de proteínas plasmáticas de igual o mayor tamaño. En el segundo caso se da por una disminución en la capacidad de reabsorción de proteínas por los túbulos.

Entre las patologías en las que se produce un aumento en la excreción de proteínas urinarias se encuentran: síndrome nefrítico, síndrome nefrótico, hipergammaglobulinemia monoclonal, nefropatía diabética, infecciones del tracto urinario.

5.3. BILIRRUBINAS EN SANGRE/BILIRRUBINEMIA

La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reacción. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción.

La bilirrubina, compuesto de degradación de la hemoglobina, es captada por el hígado para su conjugación y excreción en la bilis. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar hiperbilirrubinemias.

La hiperbilirrubinemia casi nunca es de tipo exclusivamente directo o indirecto, predominando normalmente una u otra. Aquí se presenta la clasificación más simplificada:

1.- Predominantemente indirecta.

— Producción excesiva (hemólisis, eritropoyesis ineficaz).

— Captación baja (ayuno estricto, sepsis, drogas).

— Conjugación disminuida (S. de Gilbert, Crigler-Najjar, sepsis, ictericia neonatal).

2.- Predominantemente directa

— Déficit en la excreción hepática:

I. Padecimientos hereditarios (Dubin-Johnson, colestasis intrahepática).

II. Padecimientos adquiridos (hepatitis, sepsis, colestasis intrahepática).

— Obstrucción biliar.

Los índices más altos de bilirrubina indirecta se dan en la ictericia hemolítica de MinkowskyChauffard y en el síndrome de Criggler-Najjar de tipo I; menos elevados en la anemia de Cooley o talasemia beta mayor y en la drepanocitosis, y, finalmente, son casi normales en los síndromes hemolíticos agudos con hemoglobinemia y hemoglobinuria.

La eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido es una patología provocada por incompatibilidad materno-fetal en la que se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos. Esto resulta en un severo aumento de la bilirrubina sérica con el consecuente riesgo de difusión del pigmento que puede atravesar la barrera hematoencefálica (sistema nervioso central) y originar kernicterus, por lo que la determinación de la bilirrubina en estos niños recién nacidos resulta sumamente importante.

Mucho se ha discutido sobre la cifra de bilirrubina indirecta en el recién nacido que debe considerarse como peligrosa (para muchos clínicos 20 mg/dl).

Sin embargo, se han originado kernicterus con niveles menores y se han tolerado valores hasta de 50 mg/dl y más. Habrá, pues, que tener en cuenta diversos factores: por una parte, el posible déficit de enzima de conjugación glucuronil-transferasa; por otra, la situación deficitaria en el hígado de las proteínas Y y Z, que son las encargadas de fijar la bilirrubina circulante; finalmente, la capacidad de reabsorción intestinal. Así, el prematuro ofrece mayores riesgos que el recién nacido a término. Igualmente, el sufrimiento fetal, la anoxia, la acidosis, etc., son factores a tener en cuenta y podrán indicar la necesidad de una exanguíneo-transfusión con niveles de bilirrubina indirecta por debajo de los 20 mg/dl.

5.4. UREA EN SANGRE/UREMIA

La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoníaco; éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente.

La urea constituye la fracción de nitrógeno no proteico más importante en la mayoría de los líquidos biológicos.

Por consenso, la medición de la urea se determina en nitrógeno urémico (BUN), ya que desde 1900 el nitrógeno proteico se empleaba como prueba de función renal y la mayoría del nitrógeno no proteico está en la urea. Ya que la fórmula de la urea es CO (NH2)2 y tiene un peso molecular de 60, el nitrógeno ureico (en mg/dL) representa 28/60 de la concentración total de urea. Al convertir el nitrógeno urémico a urea en milimoles por litro (como se hace para calcular la osmolaridad del plasma), el resultado del BUN debe dividirse por 2,8.

La urea se filtra por el glomérulo y se reabsorbe en los túbulos colectores junto con el agua, bajo la influencia de la hormona antidiurética. En fases de reabsorción activa del agua el aclaramiento de la urea será mucho menor que la relación entre la tasa de filtración glomerular.

La producción de urea depende de la toma de proteínas. La malnutrición lleva a bajos niveles de urea, mientras que los estados catabólicos (como el síndrome de Cushing o tras quemaduras) y en altos aportes proteícos como el sangrado intestinal, la pueden elevar. Dado que la urea se sintetiza en el hígado, la enfermedad hepática avanzada se asocia a menudo con bajos niveles de urea.

La medición del BUN emplea habitualmente la enzima ureasa, al medir la cantidad de amoníaco liberado directamente o a través de reacciones acopladas como la glutamato deshidrogenación.

5.5. CREATININA EN SANGRE/CREATININEMIA

La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con el ácido pícrico en medio alcalino dando un complejo color rojo que se cuantifica mediante lectura fotométrica. La determinación de creatinina puede llevarse a cabo por medio de una técnica de punto final, o por una técnica cinética eliminándose en ambas el color que se debe a los cromógenos no creatinina.

En el primer caso, la adición de ácido al medio, destruye el picrato de creatinina, pero no el color formado por los demás compuestos. Por lo tanto, la diferencia entre la lectura fotométrica antes y después del agregado de ácido, permite cuantificar la creatinina en forma específica.

En la técnica cinética, los cromógenos no creatinina, reaccionan dentro de los primeros 30 segundos de iniciada la reacción, que se comporta como cinética de primer orden para la creatinina. De manera que, entre los 30 segundos y los 5 minutos posteriores al inicio de la reacción, el incremento de color se debe exclusivamente a la creatinina.

Su concentración sérica es proporcional a la masa muscular del cuerpo. Las cifras normales son inferiores a 1,3 mg/dl (105 mmol/L) para el hombre y 0,9 mg/dl (79 mmol/L) para la mujer.

Existe una correlación entre la creatinina sérica y el aclaramiento de creatinina para calcular el grado de insuficiencia glomerular. Se utiliza para evaluar disfunciones renales tanto en el diagnóstico como en el tratamiento, es el caso de la monitorización de enfermos dializados. No obstante, la concentración de creatinina en plasma sólo supera el límite máximo de la normalidad cuando el aclaramiento renal de la sustancia baja a menos de la mitad de lo normal.

La creatinina, compuesto sumamente difusible, se elimina del organismo casi exclusivamente por filtración renal. Su determinación en suero, así como el clearance de creatinina endógena constituyen parámetros importantes para el diagnóstico de diversas afecciones renales. Sin embargo, debido a los problemas prácticos inherentes a la determinación del clearance (recolección de orina en niños, etc.), la determinación de creatinina sérica es más utilizada como índice de funcionalismo renal.

VI. APLICACIÓN EN CASOS CLÍNICOS

CASO CLÍNICO N°1

Paciente mujer de 80 años de edad, hipertensa de larga evolución, bien controlada y diabética tipo 2 desde hace 25 años, en tratamiento con antidiabéticos orales. Entre otros antecedentes personales, presenta hiperuricemia asintomática sin tratamiento. La paciente ingresa al servicio de urgencias Medicina Interna (MI) por gastroenteritis vírica y oliguria. En la exploración se encuentra con PA 168/76 mmHg y presenta disnea, edemas y oliguria con diarrea y rectorragias. En la analítica: creatininemia [Crp]: 3,4 mg/dl, Proteinemia: 4,7 g/dl, albúminemia: 2,3 g/dl, colesterol total: 242 mg/dl, triglicéridos: 208 mg/dl, Hb: 11,7 g/dl, leucocitos: 8700/ul, linfocitos: 14,2 %, segmentados: 69,2 %, eosinófilos: 5,1 %, Examen Completo de Orina ( ECO): proteínas ++, Hb ++, 15-20 hematíes/campo, 80-100 leucocitos/campos, bacteriuria moderada. Proteinuria en 24 horas > 10 g, proteinuria de Bence Jones negativa. Inmunoglobulinas y complemento normales; ANA, ANCA, anti-MBG, factor reumatoide, anti-PLA2R y serologías virales negativas.

CASO CLÍNICO N°2

Se presenta un recién nacido de sexo masculino, con antecedentes de ser primer hijo de madre adolescente, parto eutócico, de término (39 semanas), alimentado con lactancia materna exclusiva. Ingresó a los 8 días de vida, cuando aún no había recuperado el peso de nacimiento. Al ingreso destacaba ictericia intensa, con compromiso palmoplantar; el hígado se palpaba a 4 cm bajo el reborde costal, pero dos días después se describió a 2 cm bajo el reborde, con una proyección de 5 cm. Analítica: Bilirrubina (BT) total de 28 mg/dl, con 7 mg/dl de directa y hematocrito de 64%.

SESIÓN PRÁCTICA N° 6

Estudio de la Hemostasia-Aislamiento y Purificación de ADN Eucariótico

I. INTRODUCCIÓN.

La hemostasia es un mecanismo de defensa que protege al organismo de las pérdidas sanguíneas que se producen tras una lesión vascular. Clásicamente se ha dividido en hemostasia primaria, en la que participan fundamentalmente las plaquetas a través de los procesos de adhesión, reclutamiento, activación y agregación para formar el tapón hemostático plaquetar inicial, y fase de coagulación sanguínea (hemostasia secundaria). La deficiencia o anomalía del sistema hemostático conlleva una tendencia hemorrágica (Ej. hemofilia), mientras que una activación excesiva puede resultar en trombosis que ocluye la luz del vaso (Ej. trombosis venosa)¹.

En la década de 1960, dos grupos propusieron un modelo de coagulación que contemplaba una “cascada” enzimática compuesta por una serie de etapas secuenciales, en las que la activación de un factor de coagulación activa al siguiente, para favorecer la generación del enzima activo trombina, que convierte una proteína soluble del plasma, el fibrinógeno, en una proteína insoluble, la fibrina, componente estructural del coágulo².

Según el modelo clásico, existirían dos vías de activación, intrínseca y extrínseca, iniciadas por el factor XII y el complejo factor tisular (FT)/factor VII respectivamente, que convergen en una vía común a nivel del factor X activo (Xa). El complejo protrombinasa, compuesto por el factor Xa, Ca++ y factor Va, a nivel de superficies fosfolipídicas favorecería la generación de trombina y la formación de fibrina. Este esquema sigue siendo útil para explicar las pruebas de laboratorio empleadas para monitorizar la hemostasia, como el tiempo de protrombina (TP) para la vía extrínseca y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) para la intrínseca. Sin embargo, pronto se comprobó que ambas vías no operan de forma independiente y que el déficit de factores de la vía intrínseca que prolongan el TTPA no conlleva el mismo riesgo hemorrágico. Por ejemplo, las deficiencias de factor XII no cursan con hemorragia, y las de XI pueden cursar con hemorragia leve, mientras que las deficiencias de factores VIII y IX (hemofilia A y B respectivamente) conllevan hemorragias graves. Otra observación clave fue el hecho de que el complejo FT/VII no sólo activa el factor X, sino también el factor IX, llegándose a la conclusión de que la vía extrínseca sería la de mayor relevancia fisiopatológica in vivo³.

La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. Dada la gran variedad de métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos existentes, la elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes: a) Ácido nucleico diana; b) Organismo fuente; c) Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.); d) Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación); e) Uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de ADNc, etc.).

II. COMPETENCIAS.

2.1. Realiza un conteo manual de plaquetas utilizando cámara de Neubauer.

2.2. Determina el tiempo de protrombina y tromboplastina parcial activada.

2.3. Determina la concentración de fibrinógeno plasmático.

2.4. Analiza la importancia que supone la alteración de valores normales de analitos relacionados con la hemostasia.

2.5. Realiza la extracción de ADN a partir de muestras sanguíneas mediante un método Kit comercial.

III. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS.

.1. Materiales y equipos

.1.1. Materiales:

A. Biológico:

§ Plasma.

§ Sangre anticoagulada.

§ Suero.

B. De vidrio:

§ 10 Tubos de ensayo 10 x 75 mm

§ 4 Tubos de ensayo 15 x 100 mm

§ 2 Láminas portaobjetos

§ 1 Placa Petri 100 x 20 mm

§ 1 Cámara de Neubauer

.1.2. Reactivos:

§ Oxalato de amonio 1% (50 mL)

§ Citrato de sodio 3,2% (50 mL)

§ 01 Kit de determinación de fibrinógeno

§ 01 Kit de determinación de tiempo de protrombina

§ 01 Kit de determinación de tiempo de tromboplastina parcial activada.

§ Kit comercial Invitrogen de extracción de ADN.

§ Alcohol etílico absoluto (50 mL)

.1.3. Equipos, instrumentos y otros:

§ 01 Microscopio

§ 01 Baño maría

§ 01 Centrífuga

§ 01 Espectrofotómetro

§ 06 Micropipetas automáticas de 2-20 μL, 50-100 μL, 1001000 μL.

§ 01 Cronómetro

§ 02 Gradillas

§ Agua destilada (50 mL)

§ 05 Tubo de plástico 10 x 75 mm

§ 02 pares de guantes descartables

§ 01 Marcador indeleble

§ 05 Torundas de algodón

§ 03 Agujas descartables 20 x 1 ½ “

§ 20 Tips de micropipetas (2-50 y 100-1000 μL)

§ 10 Cubetas para espectrofotómetro 1 mL

§ 01 Ligadura § 01 Calculadora

2. Procedimientos.

2.1 Recuento de Plaquetas.

• Obtener una muestra de sangre y colocarla en un tubo de ensayo con anticoagulante EDTA. Mezclar suavemente.

• En un tubo de plástico 10 x 75 mm, colocar 100 μL de sangre anticoagulada + 1 900 μL de oxalato de amonio 1%.

• Incubar 15 minutos para provocar hemólisis.

• Homogeneizar y cargar la cámara de Neubauer con el hemolizado (unos 30 μL) y dejar que sedimenten las plaquetas en ambiente húmedo. Se recomienda colocar la cámara dentro de una cápsula de Petri conteniendo un trozo de algodón humedecido en agua.

• Dejar reposar 15 minutos en la atmósfera húmeda.

• Efectuar el recuento en microscopio (400x) en el reticulado central de la cámara (dividido en 400 cuadrados pequeños comprendidos en 1 mm2). El recuento de plaquetas se realiza en el cuadrado central, se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadraditos c/u, como se muestra a continuación.

• Cálculo: Sumar la cantidad de plaquetas y multiplicar por 1000 para obtener el número de plaquetas por mm3.

RANGO DE REFERENCIA: 150 000 – 350 000 x mm3.

2.2 Determinación del Tiempo de Protrombina (TP).

• Medición del pH de soluciones preparadas: a) Colocar una cantidad de soluciones preparadas y de muestras biológicas en tubos de ensayo rotulados como: 1, 2, 3, 4 y 5.

• Obtener sangre y colocarla en un tubo de ensayo con anticoagulante en proporción 9:1 (ejemplo 4,5 mL de sangre + 0,5 mL de anticoagulante). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos.

• Colocar el plasma en baño de agua a 37°C durante 2-3 minutos, pero no más de 10.

• En un tubo 10 x 75mm, colocar 200 μL de tromboplastina en cloruro de calcio 0,0125 mol/L y cloruro de sodio 0,1 mol/L (Soluplastin).

• Pipetear 100 μL de plasma preincubado y agregarlo al tubo que contiene tromboplastina, poniendo en marcha el cronómetro simultáneamente.

• Mantener el tubo dentro del baño unos 5 segundos y cerca de la luz.

• Luego, sacar el tubo del baño, inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener el cronómetro en el momento de aparición del coágulo.

• Realizar el procedimiento por duplicado.

• Calcular el tiempo promedio por duplicado. Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es mayor del 5%, se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores.

• RANGO DE REFERENCIA: 10 – 14 seg.

2.3 Determinación del tiempo de Tromboplastina Parcial activada (TTPA)

• Colocar en baño de agua a 37°C unos 300 μL de cloruro de calcio 0,025 mol/L.

• En un tubo de ensayo 10 x 75mm colocar 100 μL de plasma y 100 μL de Cefalina (reactivo APTTest) e incubar 4 minutos en baño de agua a 37°C.

• Agregar 100 μL de cloruro de calcio precalentado y poner en marcha el cronómetro inmediatamente.

• Agitar brevemente para homogeneizar el contenido y mantener el tubo en el baño unos 20 segundos.

• Luego, sacar el tubo del baño, inclinar suavemente una vez por segundo y detener el cronómetro en el momento de la formación del coágulo.

• Tomar nota del tiempo.

RANGO DE REFERENCIA: 30 – 45 seg.

2.4 Determinación de Fibrinógeno.

• Preparar una dilución 1:10 del plasma del paciente en Buffer Imidazol.

Ejemplo: 50 μL plasma + 450 μL de buffer.

• Incubar 200 μL de la dilución a 37ºC durante 2 minutos.

• Rápidamente adicionar 100 μL de Trombina y registrar el tiempo de formación del coagulo.

• Repetir la determinación y promediar el resultado.

• Conocido el tiempo de coagulación del paciente, ingresar este valor a la recta estándar e interpolar el valor de fibrinógeno en cada caso.

RANGO DE REFERENCIA: 200 – 400 mg/dL.

2.5 Extracción de ADN Eucariótico (Método Invitrogen)⁵.

• Obtener la muestra de sangre con el sistema Vacutainer.

• Lisis Celular:

1) Colocar el Baño maría a 55°C.

2) Añadir, a un tubo de microcentrífuga estéril, 200 μl de muestra de sangre fresca o congelada (si el volumen de muestra es menos de 200 μl ajustar el volumen de muestra a 200 μl usando PBS 1X).

3) Añadir 20 μl Proteinasa K a la muestra.

4) Añadir 20 μl RNasa A a la mezcla anterior, mezclar bien con vortex e incubar a temperatura ambiente por 2 minutos.

5) Añadir 200 μl de buffer de lisis/binding y mezclar bien con vortex hasta obtener una solución homogénea.

6) Incubar a 55°C por 10 minutos para promover la digestión de la proteína.

7) Añadir 200 μl de etanol 96-100% al lisado. Mezclar bien con vortex por 5 segundos para producir una solución homogénea.

• Binding DNA

1) Remover una columna Spin PureLink del paquete del kit.

2) Añadir el lisado (~ 640 μl) obtenido a la columna Spin.

3) Centrifugar la columna a 10000xg por 1 minuto a temperatura ambiente.

4) Descartar el tubo de colección y colocar la columna Spin en un tubo de colección PureLink disponible en el kit.

• Washing DNA

1) Añadir 500 μl de buffer wash 1 preparado a la columna.

2) Centrifugar la columna a temperatura ambiente a 10000xg por 1 minuto.

3) Descartar el precipitado líquido del tubo de colección y colocarlo a la columna Spin.

4) Añadir 500 μl de buffer wash 2 preparado a la columna.

5) Centrifugar la columna a velocidad máxima (12000xg) por 3 minutos a temperatura ambiente. Descartar el tubo de colección.

• Eluting DNA

1) Colocar la columna en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. 2) Añadir 100 μl de buffer de elución PureLink a la columna.

3) Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Centrifugar la columna a máxima velocidad por 1 minuto a temperatura ambiente.

4) Recuperar más ADN siguiendo un segundo paso de elución.

5) Centrifugar la columna a máxima velocidad por 1.5 minutos a temperatura ambiente.

6) Remover y descartar la columna.

El tubo contiene ADN purificado.

• Storing DNA

1) Almacenar el ADN purificado a – 20°C o usar el ADN para la aplicación inmediata deseada.

2) Para almacenajes más largos se debe almacenar en buffer de elución a -20°C pero no en agua debido a que el ADN estaría sometida a hidrólisis ácida.

3) Si el ADN es almacenado a 4°C se debe usar inmediatamente en alícuotas para evitar daños por congelamiento y descongelación. En lugar de ello distribuir

la solución de ADN en alícuotas las cuales deberán ser almacenadas a -20°C por mucho tiempo.

3. Manejo de Residuos.

• Las muestras biológicas y las soluciones son eliminadas sin antes disminuir su capacidad tóxica con neutralizantes y detergente.

IV. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

1. Wiener lab. Group. Vademecum de Reactivos [en línea] 2016 [acceso: 2016 agosto 10] Disponible en: http://www.wiener lab.com.ar/ES/SitePages/Vademecum.aspx .

2. Páramo JA, Panizo E, Pegenaute C, Lecumberri R. Coagulación 2009: Una visión moderna de la hemostasia. Rev Med Univ Navarra. 2009; 53 (1): 19-

23.

3. Prieto Valtueña JM, Yuste Ara JR. Balcells: La Clínica y el laboratorio. 21° ed.

Barcelona-España: Masson-Elsevier; 2010.

4. Llontop, J. y Ñique, C. Manual de Protocolos de Genética Médica 2019-I. Escuela de Medicina, Facultad de Medicina. Universidad Católica Santo Toribio de Mogrovejo, 2019.

5. Life Technology Corporation User Guide PureLink Genomic DNA Kits, USA, 2012. Disponible en:

http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_genomic_man.pdf

V. FUNDAMENTACIÓN METODOLÓGICA Y CLÍNICA

5.1. DETERMINACIÓN DE FIBRINÓGENO.

El ensayo se basa en el método de Clauss, designado como procedimiento de referencia por el NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Cuando un exceso de trombina se adiciona a un plasma diluido, el tiempo de coagulación es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno plasmático. El tiempo de coagulación obtenido se compara posteriormente con una preparación de fibrinógeno estandarizada. El fibrinógeno es una glicoproteína que se halla presente en el plasma y en los gránulos plaquetarios α. Es el factor de la coagulación que se encuentra en mayor concentración plasmática (200-500 mg/dl).

Cuando se produce un trauma o injuria vascular, la trombina formada escinde al fibrinógeno convirtiéndolo en monómeros de fibrina que polimerizan espontáneamente y luego son estabilizados dando lugar a la malla insoluble de fibrina.

Niveles bajos de fibrinógeno pueden encontrarse en desórdenes hereditarios tales como hipofibrinogenemia, afibrinogenemia, disfibrinogenemia, y también en otras circunstancias como enfermedad hepática, coagulación intravascular diseminada, síndromes fibrinolíticos, etc. Niveles elevados pueden encontrarse en diabetes, enfermedad inflamatoria, etc. Actualmente se ha reconocido que niveles altos de fibrinógeno aumentan el riesgo a padecer enfermedad cardiovascular.

5.2.DETERMINACIÓN DE TIEMPO DE PROTROMBINA.

Este ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado a 37°C y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. El método no detecta deficiencias de factores de la vía intrínseca (VIII, IX, XI y XII).

El fenómeno de la coagulación sanguínea puede desencadenarse por una vía extrínseca (por lesión tisular) o por una vía intrínseca (por contacto de la sangre con epitelios distintos del epitelio vascular normal e intacto o con superficies extrañas).

Entre las distintas pruebas de exploración de los factores que intervienen en la coagulación, la determinación del tiempo de protrombina o tiempo de Quick es de las consideradas entre las de primer orden de utilidad.

Originalmente se pensó que el método de Quick medía únicamente la actividad protrombínica (factor II) del plasma, de allí su nombre; sin embargo el descubrimiento de nuevos factores permitió concluir que dicho método es una prueba global para evaluar la coagulación extrínseca, siendo sensible a factor II (protrombina), factor V (proacelerina), factor VII (proconvertina) y factor X (Stuart-Prower).

Por lo tanto, la determinación se aplica a:

- Estudios de problemas hemorrágicos, como los realizados de rutina en los análisis pre quirúrgicos.

- Detección de alteraciones en los niveles de uno o más factores involucrados en la vía extrínseca, originadas por enfermedades hereditarias, patologías hepáticas, administración de fármacos, enfermedad hemolítica del recién nacido, ictericia obstructiva.

- Control de la terapéutica con anticoagulantes orales como warfarina.

5.3.DETERMINACIÓN DE TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA.

El ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado en un baño a 37°C y en presencia de un exceso de cefalina, activador y calcio.

El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), es una prueba sensible a la deficiencia de factores procoagulantes del plasma, así como a la presencia de ciertos inhibidores de la coagulación. Sirve para detectar anormalidades en la vía intrínseca de la coagulación, como son los factores necesarios para la formación del activador intrínseco de la protrombina, o sea los factores VIII, IX, XI y XII.

También detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibrinógeno, no siendo así con los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas vasculares. La rapidez, sencillez y reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de la terapéutica anticoagulante por heparina. También permite la identificación rápida de hemofílicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos pre quirúrgicos y evitar problemas hemorrágicos.

5.4.RECUENTO DE PLAQUETAS.

El oxalato de amonio al 1% en solución acuosa es un medio hipotónico que destruye los eritrocitos y permite el conteo de plaquetas.

Para obtener el número de plaquetas por mm3 se multiplica por 1000. El factor 1000 surge del producto:

Donde 20 es el factor de dilución, 400 son los cuadraditos totales y 80 los cuadraditos contados. El volumen total del cuadrante es de 0,1 mm3.

El mecanismo fisiológico de la hemostasia comprende cuatro fases:

- Vasoconstricción en el área lesionada.

- Adhesión y agregación plaquetaria.

- Fibrinoformación, que refuerza el trombo plaquetario.

- Fibrinolisis o eliminación de los depósitos de fibrina.

Uno de los parámetros a evaluar en problemas de hemostasia de rutina es el recuento plaquetario, el cual debe mantenerse entre 150 y 450 mil trombocitos por mm3 o μL. Estos valores pueden verse alterados como trombocitosis (aumento) o trombocitopenia (disminución) debido a variados factores.

La trombocitosis como síndrome mieloproliferativo crónico se caracterizas por una cifra superior de plaquetas a 600 mil / μL; este síndrome cursa con episodios trombóticos y hemorrágicos, ya que las plaquetas suelen ser disfuncionales.

Las trombocitopenias se clasifican en centrales (generalmente por un defecto en la médula ósea) o periféricas (por una alteración de las plaquetas circulantes). Aunque se habla de trombocitopenia cuando el recuento es inferior a 150.000/μL, es raro que aparezcan sangrados espontáneos por encima de 50.000/μL.

5.5. EXTRACCIÓN DE ADN.

La extracción de ADN es un paso esencial antes de realizar cualquier procedimiento en biología molecular, tal como la PCR. Existe una diversidad de métodos para realizar la extracción, el procedimiento debe ser diseñado para el tipo de organismo (procariota, planta, sangre humana, tejidos, etc.) del cual se va obtener el ADN, debido a que la estructura y composición química de los organismos varían.

El primer paso es la lisis de la célula con una solución buffer de Tris HCl/EDTA que se usa como agente quelante de proteínas de membrana. Los lípidos se emulsionan y desnaturalizan con detergentes como el dodecil sulfato de sodio (SDS)

El siguiente paso es disociar las proteínas básicas unidas al ADN mediante una enzima, la proteinasa K.

Para concentrar el ADN, la solución se precipita con etanol absoluto en presencia de un catión monovalente. El ADN es recuperado por centrifugación y resuspendido en un medio apropiado.

El acetato de amonio se usa por lo común para reducir la coprecipitaciones de dNTPs. Dos precipitaciones secuenciales con acetato de amonio 2M pueden eliminar en un 99% la presencia de dNTPs.

Una parte importante es conocer la concentración de ADN, para ello se usa un espectrofotómetro de luz UV a 260 y 280 nm. La lectura a 260nm permite conocer la concentración de ADN en la muestra, mientras que la proporción de lecturas a 260/280nm permite conocer la pureza de la muestra. Como método alternativo se hace una estimación con el agente fluorescente Bromuro de Etidio. Este método se basa en una curva de concentración hecha con un ADN conocido y la comparación de la muestra en un Transiluminador UV. La desventaja de este método es la contaminación de la muestra con ARN que tiene fluorescencia similar, reportando una concentración falsa.

El considerable avance de la genética molecular en los últimos años ha hecho posible el análisis de los distintos genes y de las alteraciones causantes de numerosas enfermedades, tanto monogénicas como poligénicas. El ADN, que es base molecular de la herencia, está localizado en el núcleo celular formando parte esencial de los cromosomas y en la mitocondria, donde se codifican algunas de las proteínas que forman los complejos de la cadena respiratoria. El tamaño del genoma nuclear es de 3 x 109 nucleótidos, de los cuales solo 1-2% son secuencias codificantes o con un mensaje. Esta parte del ADN da cuenta de los más de 31 000 genes del genoma. El resto (98-99%) lo constituye el ADN intercalado entre los genes y entre las secuencias codificadoras de cada gen. El ADN mitocondrial tiene un tamaño de 16,5 kilobases (kb), es circular y contiene 37 genes. Se hereda por vía materna ya que, durante la formación del cigoto, el espermatozoide aporta solo su ADN nuclear y no el mitocondrial. De esta manera, los genes codificados por el ADN mitocondrial no son transmitidos por los varones a su descendencia. Las enfermedades genéticas comprenden los siguientes grupos:

ü Enfermedades por alteraciones cromosómicas, que incluyen pérdida, ganancia o la reorganización de un o más cromosomas afectando a múltiples genes.

ü Enfermedades monogénicas causadas por la mutación de un gen, como puede ser la fibrosis quística, la hemofilia A, la corea de Huntington y la distrofia muscular de Duchenne.

ü Enfermedades multifactoriales causadas por las interacciones de varios genes y diversos factores ambientales. La hipertensión arterial, la diabetes mellitus y la enfermedad coronaria se incluirían en este grupo. Las enfermedades cromosómicas y monogénicas, en su conjunto, afectan al 2% de la población y son la causa del 8% de las hospitalizaciones en edad infantil. Si se consideran los tres grupos, hasta un 60% de los individuos padece o padecerá, a lo largo de su vida, una enfermedad de causa genética. Cada uno de estos tres grupos de enfermedades genéticas, presenta diferentes aspectos en lo que respecta a su diagnóstico, consejo genético y tratamiento.

Las técnicas de extracción de ADN también tienen aplicación en:

• Diagnóstico rápido de infecciones bacterianas, fúngicas y virales.

• Detección de microorganismos en células infectadas/transformadas.

• Determinación de la relación genética entre varios tipos de microorganismos similares.

• Correlacionar la presencia/expresión de agentes virales/infecciosos en tejidos neoplásicos.

• Determinar la resistencia a los antibióticos de las bacterias.

• Epidemiología de las infecciones.

• Detectar y cuantificar microorganismos difíciles de cultivar o para los que no existen reactivos serológicos.

• Detectar regiones transformantes específicas en virus.

VI. APLICACIÓN EN CASOS CLÍNICOS

CASO CLÍNICO N°1

Se presentó una niña de 3 años con hemorragias petequiales y hemorragias nasales de repetición. Dos semanas antes había ingresado al hospital HNAAA con hemorragias nasales acompañadas de 2 episodios de vómitos de sangre roja oscura. La paciente tenía antecedentes de propensión a magulladuras, sangrado de encías de repetición, pero sin hemartrosis. No presentaba antecedentes familiares de hemorragias anormales. Un día antes del ingreso real, la paciente tuvo hemorragias nasales nuevamente, esta vez, acompañados por 4 episodios de hematemesis y heces negras. En el examen, se veía pálida, con signos vitales normales. Su piel presentaba petequias dispersas. Los resultados de la evaluación de laboratorio incluyeron: LEUCOCITOS=8.2x 10³ /uL [VR 4-10 x 10³/uL]; Hb: 10.7 g/dl (VR: 11 a 15 g/dl); PLTs, 142 x 10³ /uL (VR: 150450x10³/uL), Tiempo de protrombina (TP): 11.5 s (VR: 11 a 14 s); Tiempo de Tromboplastina Parcial Activado (TTPA): 31.2 s (VR: 25 a 35 s) y fibrinógeno, 2.5 g/l (VR: 200-400 mg/dl). El frotis de sangre periférica no mostró grupos de plaquetas normales. Una evaluación de citometría de flujo demostró una marcada reducción de glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/ IIIa). La paciente fue dada de alta en buenas condiciones después de la inserción de taponamiento nasal.

CASO CLÍNICO N°2

Paciente de 66 años de edad, masculino y piel blanca, con antecedentes de HTA y adenocarcinoma prostático. Ingresó por enterorragia, con requerimientos transfusionales. Se interconsultó con Hematología por presencia de grandes hematomas en músculos, en extremidades superiores e inferiores Se realizaron estudios de la coagulación con los siguientes resultados: TPTa (tiempo parcial de tromboplastina activada) prolongado que no corrigió con la adición de plasma normal, con cifras normales de fibrinógeno, además de PDF (productos de degradación del fibrinógeno) y DD (dímero D) negativos. Se realizó estudio de coagulación en el Instituto de Hematología e Inmunología, donde se constató un TPTa: C-34,2 s, P-86,8 s con corrección -84,1 s; se dosificó FVIII: 4,6 % (normal 50-150 %) y se realizó curva de inhibidores: 32 UB/mL (Bethesda), anticoagulante lúpico negativo. Se comprobó la presencia de inhibidor del FVIII, y se diagnosticó una HAA. Se puso tratamiento inmunosupresor con prednisona 1mg/kg de peso.

SESIÓN PRÁCTICA N° 7

Metabolismo de Nucleótidos y Transformación de Plásmido PGLO

I. INTRODUCCIÓN.

Los nucleótidos tienen los metabolismos más complejos. Su biosíntesis es larga e implica un alto requerimiento de energía por lo que es comprensible que las bases y los nucleótidos no sean degradados totalmente si no que en gran parte puedan ser reutilizados^.En el organismo humano las purinas se degradan hasta ácido úrico, el que se elimina como tal. El anillo de la purina permanece intacto. En cambio, el anillo de las bases pirimídicas (uracilo, timina y citosina) se rompe en pequeños fragmentos que se incorporan nuevamente al metabolismo o que pueden ser eliminados ¹.

El hecho de que la degradación de las purinas en el hombre termine en la producción de ácido úrico puede ocasionar problemas. El ácido úrico, a diferencia de la alantoína es muy poco soluble en agua. Cuando existe una oferta elevada de ácido úrico o hay una alteración en su utilización, puede producirse una concentración excesiva del ácido en la sangre (hiperuricemia) y como consecuencia de ello puede depositarse cristales de ácido úrico en el organismo. La localización de estos depósitos en las articulaciones es la causa de los tan dolorosos ataques de gota. Los casos de hiperuricemia generalmente se deben a una alteración de la eliminación renal de ácido úrico. Los alimentos ricos en purinas (la carne) también pueden ser contraproducentes².

La introducción de diferentes técnicas de biología molecular ha contribuido en forma crucial al vertiginoso avance que ha experimentado la medicina. Una de las herramientas básicas de la biotecnología moderna es el rompimiento del ADN, cortándolo y uniéndole otras moléculas complementarias del material genético. El concepto básico detrás del rompimiento del ADN es el remover un fragmento funcional del ácido nucleico, digamos, un gen de un organismo y combinarlo con el ADN de otro organismo para crear la proteína a la cual ese gen codifica. La transformación ocurre cuando una célula toma para sí misma y expresa una nueva pieza de material genético. La transformación permite la reproducción de genes, la selección y la expresión de un gen y de su proteína. La selección positiva para las células transformadas con el ADN de plásmido que contiene un gen que confiere resistencia a un determinado antibiótico, es lograda por el crecimiento en una placa Petri. Esta actividad única de la transformación se basa en que los portadores del gen del plásmido pGLO codificaron para la proteína verde fluorescente (GFP). El sistema del pGLO incorpora un promotor de la arabinosa que controla exactamente la expresión del GFP en células transformadas. La expresión del gen de GFP se puede expresar simplemente incluyendo la arabinosa, un azúcar, en el medio del crecimiento o cultivo. La resistencia a la ampicilina (AMP), un antibiótico, se utiliza como un mecanismo de selección para la transformación. Las células transformadas con el plásmido pGLO, pueden aparecer sin fluorescencia en el medio de cultivo que no contiene arabinosa, y verde fluorescente cuando la arabinosa se incluye en el agar. La construcción única del pGLO permite a educadores y a estudiantes explorar fácilmente mecanismos de la regulación de los genes y de la selección genética. El proceso entero es observable con una lámpara de rayos UV de mano o bolsillo. El sistema del pGLO también permite un experimento adicional que implica la purificación de la proteína recombinante⁴.

II. COMPETENCIAS.

2.1. Determina la concentración de ácido úrico en suero sanguíneo.

2.2. Comprende los principios de la transformación de bacterias con plásmidos y la regulación genética, utilizando el Kit Bacterial Transformation pGLO (BIORAD®).

III. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS.

1) Materiales y equipos

3.1.1. Materiales:

A. Biológico:

§ Suero sanguíneo.

§ Cultivo liofilizado de Escherichia coli § Plásmido pGLO.

B. Reactivos:

§ 01 Kit de determinación de ácido úrico. § 200 ml Buffer estéril de transformación § 2 L Agua destilada.

C. De metal:

§ 02 trípode + rejilla.

D. De vidrio:

§ 03 Matraz 1 L

§ 03 Matraz 500 mL

§ 40 placas petri estériles § 20 microtubos estériles de 2 mL

3.1.2. Equipos, instrumentos y otros:

§ 01 baño maría 37°C

§ 01 Estufa 37°C

§ 01 Espectrofotómetro

§ 01 Centrífuga

§ 01 Balanza analítica

§ Micropipetas de 2-20 μL, 50-100 μL, 100-1000 μL.

§ 01 Mechero bunsen + gas.

§ 02 Gradillas.

§ 40 asas bacteriológicas estériles

§ 04 Gradillas para los microtubos “eppendorf”

§ 01 Lámpara de rayos UV de onda larga

§ 01 Termómetros

§ 01 Refrigerador

§ Micropipetas Automáticas de 2-20 μL, 50-100 μL, 100-1000 μL

§ 200 g Algodón.

§ 03 Plumones o marcadores de diferentes colores.

2) Procedimientos.

3.2.1. Determinación de ácido úrico en sangre.

• Obtener una muestra de sangre de una persona en ayuno.

• Extraer suero de manera usual y realizar la prueba de determinación de ácido úrico en sangre de acuerdo al siguiente cuadro:

Blanco Standard Muestra

Tubo

(B) (S) (D)

Standard (µL) --- 25 ---

Muestra (suero) (µL) --- --- 25

Reactivo de trabajo (suero) (µL) 1000 1000 1000

Mezclar por agitación suave e incubar 5 min a 37°C o 10 min a temperatura del ambiente. Leer a 520 nm, llevando el aparato a cero con el blanco de reactivo. El color es estable 30 min.

• Cálculos:

Ácido úrico (mg/dL)= D x f

𝑚𝑔

10( )

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 = ^𝑑𝑙

𝐴𝑏𝑠. 𝑆𝑡

§ Valores de referencia:

- Varones: 3,6-7,7 mg/dL

- Mujeres: 2,5-6,8 mg/dL

3.2.2. Transformación bacteriana con plásmido pGLO.

• Escribir en un microtubo cerrado (Eppendorf) + pGLO y en otro, – pGLO. Rotular cada tubo con el nombre del grupo y colocarlos en una gradilla.

• Utilizar una pipeta y transferir 250 μL de solución de transformación (CaCl2). Colocar los tubos en hielo.

• Utilizar un asa estéril para tomar una sola colonia de bacterias de su placa inicial. Tomar el tubo que dice +pGLO y sumergir el asa en la solución de transformación que está en el fondo del tubo; girar hasta que toda la colonia esté dispersa en la solución de transformación. Colocar el tubo en la gradilla que está en el hielo.

• Utilizando un asa estéril sin tomar ninguna colonia bacteriana, realizar el mismo procedimiento en el tubo marcado como – pGLO.

• Examinar la solución ADN pGLO con la lámpara UV. Anotar observaciones.

• Sumergir un asa estéril en el tubo con ADN plasmídico y tomar una muestra. Debe haber una película de plásmido en el asa.

• Mezclar la muestra tomada con el asa, en la suspensión celular en el tubo + pGLO; cerrar el tubo y regresarlo a la gradilla con hielo. Cerrar también el tubo – pGLO. No añadir plásmido en el tubo – pGLO.

• Incubar los tubos en hielo por 10 minutos. Asegurarse de empujar los tubos hasta abajo en la gradilla para que hagan contacto con el hielo.

• Mientras que los tubos están en hielo, rotular las 4 placas de agar como sigue:

a. LB/amp -------------------- + pGLO

b. LB/amp/ara --------------------- + pGLO

c. LB/amp --------------------- – pGLO

d. LB --------------------- – pGLO

• Choque da calor: utilizando la gradilla como sostén, transferir ambos tubos (+) y (–) en el baño maría a 42°C por 50 segundos. Asegurarse de que los tubos toquen el fondo y se pongan en contacto con el agua caliente. Después del tiempo sugerido, regrese ambos tubos al hielo. Para mejores resultados en la transformación, el cambio del hielo (0°C) a 42°C y después al hielo otra vez, debe ser rápido. Incubar los tubos en hielo por 2 minutos.

• Retirar la gradilla que estaba en el hielo y ponerla en el asiento de una banca, abriendo los tubos y añadiendo 250 μL de LB a cada tubo con una pipeta estéril.

• Cerrar e incubar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente.

• Tomar los tubos cerrados y agitar. Utilizando una pipeta estéril para cada tubo, pipetear 10 mL de la suspensión transformada y la de control en un punto de la placa.

• Usar un asa estéril para cada placa. Esparcir la suspensión sobre la superficie del agar con el asa estéril.

• Apilar las placas y sellarlas con parafilm. Poner el nombre del equipo de trabajo y colocarlas boca abajo en la incubadora a 37°C hasta el día siguiente.

3) Manejo de Residuos.

• Los residuos de saliva se vierten en el fregadero sin antes descontaminarlo con hipoclorito de sodio.

• Los materiales de vidrio serán lavados con agua y detergente, enjuagándose con agua destilada y secándose en el horno a 100 °C por 2 horas para su reutilización.

IV. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

1. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol., 1983; 166-557.

2. Hanahan D. Techniques for transformation of E. coli. In DNA Cloning: A Practical Approach (Ed. D. M. Glover), vol. 1. Oxford: IRL Press; 1987.

3. Schleif R. Two positively regulated systems, ara and mal, In Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, Neidhardt. Washington, D.C.: ASM Press; 1996.

4. Devlin T. Bioquímica. Libro texto con aplicaciones clínicas. 4ª ed. España:

Reverté S.A.; 2004.

V. FUNDAMENTACIÓN METODOLÓGICA Y CLÍNICA

5.6. ÁCIDO ÚRICO.

El ácido úrico presente en la muestra reacciona en medio acuoso, en presencia de oxígeno y uricasa, para producir alantoína, peróxido de hidrógeno y anhídrido carbónico. El peróxido de hidrógeno producido se enfrenta con una peroxidasa, 4-aminofenazona y ferrocianuro de potasio en una solución de diclorohidroxibenceno sulfónico (DHS) en buffer fosfato a pH 7,4. Esta reacción produce una quinonimina roja que se mide a 505 nm.

El ácido úrico es el producto nitrogenado resultante del metabolismo de purinas tanto endógenas (nucleoproteínas celulares) como exógenas (dieta). Se excreta principalmente por vía renal y en menor grado por vía intestinal. Las concentraciones plasmáticas en el varón son superiores a la mujer.

Los casos de hiperuricemia se presentan por alteraciones enzimáticas: déficit de hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HGPRT), aumento de actividad de 5- fosforribosil-1-pirofosfato-sintetasa y glucogenosis tipo I (von Gierke); por aumento del catabolismo de ácidos nucleicos; o también por defecto e la excreción de ácido úrico: por insuficiencia renal, inhibición farmacológica de la diuresis, consumo excesivo del alcohol, situaciones de acidosis (cetoacidosis diabética, alcohólica y láctica).

Por otro lado, la hipouricemia se puede producir por hemodilución en caso de administración de sueros parenterales; por producción disminuida (déficit de xantina oxidasa, porfiria aguda); o por eliminación renal aumentada.

5.7. TRANSFORMACIÓN BACTERIANA/ADN RECOMBINANTE

La transformación genética consiste en la inserción de un ADN nuevo en las células de E. coli. Además de un cromosoma grande, las bacterias contienen a menudo una o más piezas pequeñas circulares de ADN llamados plásmidos. Un plásmido, por lo general contiene genes que codifican más de un rasgo. Los científicos pueden utilizar un proceso llamado ingeniería genética para insertar genes que codifican para nuevas características en un plásmido. En este caso, el plásmido PGLO porta el gen GFP que codifica para la proteína verde fluorescente y un gen (bla) que codifica para una proteína que le da la resistencia bacteriana a un antibiótico. El plásmido de ingeniería genética se puede utilizar para transformar genéticamente bacterias, para dar a esta nueva característica.

El procedimiento de transformación consta de tres pasos principales. El propósito es introducir el plásmido de ADN en las células de E. coli y proporcionar un ambiente para que las células expresen los genes adquiridos.

En primer lugar, se altera el ambiente extracelular con cloruro de calcio. Luego se genera un shock térmico para que el plásmido pueda atravesar la pared y membrana celular; finalmente, se da las condiciones para que la bacteria exprese las características que le confiere el plásmido adquirido.

Los organismos regulan la expresión de sus genes y las cantidades y tipos de proteínas de sus células por muchas razones, incluyendo cambios en el desarrollo, especialización celular y adaptación al ambiente. La regulación de los genes no sólo permite la adaptación a distintas condiciones, sino que también evita la sobreproducción de proteínas, situación innecesaria que pondría al organismo en una desventaja competitiva. Los genes implicados en el transporte y la degradación (catabolismo) de los alimentos son buenos ejemplos de genes altamente regulados. Por ejemplo, el azúcar arabinosa es una fuente de energía y una fuente de carbono. La bacteria E. coli produce tres enzimas (proteínas) necesarias para digerir arabinosa como fuente de alimento. Los genes que codifican estas enzimas no se expresan cuando arabinosa no está presente, pero se expresan cuando existe arabinosa en su entorno. ¿Cómo es esto?

La regulación de la expresión de las proteínas ocurre a menudo a nivel de la transcripción de ADN en ARN. Esta regulación se lleva a cabo en un lugar muy específico en la plantilla de ADN, llamado promotor, donde la ARN polimerasa comienza la transcripción del gen. En las bacterias, los grupos de genes relacionados a menudo se agrupan y se transcriben

El Operón Arabinosa

El código del ADN del plásmido pGLO ha sido diseñado para incorporar los aspectos de la operón arabinosa. Tanto el promotor (PBAD) y el gen araC están presentes. Sin embargo, los genes que codifican para el catabolismo de arabinosa, araB, A y D, han sido sustituidos por el gen que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP). Por lo tanto, en presencia de arabinosa, la proteína araC promueve la unión de la ARN polimerasa y entonces se produce GFP. Las células muestran fluorescencia verde brillante, ya que producen GFP. En ausencia de arabinosa, araC no facilita la unión de la ARN polimerasa y el gen de la GFP no se transcribe. Cuando GFP no se codifica, las colonias de bacterias aparecerán como las de tipo salvaje (natural), con un color blanco, sin fluorescencia.

Expresión de la Proteína Verde Florescente

Se conocen más de 4000 enfermedades genéticas diferentes, muchas de las cuales son debilitadoras o fatales. La mayoría son incurables. Con las nuevas tecnologías de la biología molecular, la aplicación médica de la transferencia de genes y la terapia génica se están convirtiendo en una realidad. La deficiencia de adenosina desaminasa (ADA)

solo dos de las muchas enfermedades genéticas que pueden curarse fácilmente por terapia génica. La ADA es una enzima importante de la ruta de recuperación de purinas y cataliza la conversión de la adenosina en inosina o de la desoxiadenosina en desoxiinosina. Es una proteína de 363 aminoácidos con una alta actividad en el timo y otros tejidos linfáticos. La enfermedad se hereda como un trastorno autosómico recesivo. Hay más de 30 mutaciones asociadas a esta enfermedad. La deficiencia de ADA causa una grave inmunodeficiencia combinada (SCID). Los niños con este mal mueren en los primero años de vida a causa de infecciones múltiples. La primera terapia génica autorizada en el hombre empezó el 14 de septiembre de 1990, con el tratamiento de una niña de 4 años con deficiencia de ADA. Las células T de la sangre periférica de la paciente se multiplicaron en cultivo con los factores de crecimiento adecuados. El gen ADA se introdujo en el interior de estas células mediante transferencia génica facilitada por un retrovirus. Para ello, se construyó un retrovirus modificado, que contenga el gen humano ADA, que pudiera expresar el gen, pero sin replicarse. (Estos virus que no pueden replicarse fueron propagados primero en una línea celular que contenía un virus asistente integrado que permitía la producción de virus “infecciosos”. Estos virus infecciosos con información génica foránea pueden infectar y transmitir información a células sin virus asistentes, pero no pueden replicarse en ellas). La transferencia génica del gen ADA fue realizada por medio de una infección retrovírica de las células T de la paciente. Las células T modificadas que eran portadoras del gen ADA normal, fueron reintroducidas en la sangre de la paciente mediante transfusión autóloga. Niveles de ADA de tan solo un 10% son suficientes para normalizar al paciente. El paciente que tiene 21 años, está vivo y bien y ha mantenido las células T circulantes corregidas en su gen a un nivel de 20-25% del total de células T.

Transformation Kit—Quick Guide

1. Label one closed micro test tube +pGLO and another -pGLO. Label both tubes with your group’s name. Place them in the foam tube rack.

2. Open the tubes and using a sterile transfer pipet, transfer 250 μl of transformation solution (CaC12).

3. Place the tubes on ice.

4. Use a sterile loop to pick up a single colony of bacteria from your starter plate. Pick up the +pGLO tube and immerse the loop into the transformation solution at the bottom of the tube. Spin the loop between your index finger and thumb until the entire colony is dispersed in the transformation solution (with no floating chunks). Place the tube back in the tube rack in the ice. Using a new sterile loop, repeat for the -pGLO tube.

5. Examine the pGLO plasmid DNA solution with the UV lamp. Note your observations. Immerse a new sterile loop into the plasmid DNA stock tube. Withdraw a loopful. There should be a film of plasmid solution across the ring. This is similar to seeing a soapy film across a ring for blowing soap bubbles. Mix the loopful into the cell suspension of the +pGLO tube. Close the tube and return it to the rack on ice. Also close the - pGLO tube. Do not add plasmid DNA to the -pGLO tube. Why not?

6. Incubate the tubes on ice for 10 minutes. Make sure to push the tubes all the way down in the rack so the bottom of the tubes sticks out and make contact with the ice.

7. While the tubes are sitting on ice, label your four agar plates on the bottom (not the lid) as follows: Label one LB/amp plate: +pGLO; Label the LB/amp/ara plate: +pGLO; Label the other LB/amp plate: -pGLO; Label the LB plate: - pGLO.

8. Heat shock. Using the foam rack as a holder, transfer both the (+) pGLO and (-) pGLO tubes into the water bath, set at 42 °C, for exactly 50 seconds. Make sure to push the tubes all the way down in the rack so the bottom of the tubes sticks out and make contact with the warm water. When the 50 seconds are done, place both tubes back on ice. For the best transformation results, the change from the ice (0°C) to 42°C and then back to the ice must be rapid. Incubate tubes on ice for 2 minutes.

9. Remove the rack containing the tubes from the ice and place on the bench top. Open a tube and, using a new sterile pipet, add 250 μl of LB nutrient broth to the tube and reclose it. Repeat with a new sterile pipet for the other tube. Incubate the tubes for 10 minutes at room temperature.

10. Tap the closed tubes with your finger to mix. Using a new sterile pipet for each tube, pipet 100 μl of the transformation and control suspensions onto the appropriate plates.

11. Use a new sterile loop for each plate. Spread the suspensions evenly around the surface of the agar by quickly skating the flat surface of a new sterile loop back and forth across the plate surfac

12. Stack up your plates and tape them together. Put your group name and class period on the bottom of the stack and place the stack upside down in the 37°C incubator until the next day.

VI. APLICACIÓN EN CASOS CLÍNICOS

CASO CLÍNICO

Varón de 74 años que en su primera visita refiere tumoraciones duras en varias articulaciones de pies y manos, “desde siempre”, con eritema cutáneo en tumoración, indolora. No existe analítica previa. Refiere que “cree haber tenido hiperuricemia”, sin tratamiento. Pendiente de realización de analítica, tras varias semanas, acude de nuevo con dolor, eritema y exudado blanquecino, derivamos a urgencias hospitalarias para descartar artritisséptica.

Exploración física: Tumoraciones duras bilaterales y mano derecha, no lesiones cutáneas. En episodio agudo: eritema con dolor y exudado blanquecino de primer dedo de pie izquierdo.

Analítica: Ac. Úrico 7.9, Cr 1.18, Urea 45, FR - Líquido sinovial cristales de urato monosódico Cultivo exudado flora saprófita Rx pie reabsorción de falange distal.

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Transformation Kit—Quick Guide

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